Determinacion de azucares totales-Metodo fenol sulfurico

 

Materiales y equipo.

-Tubos de ensayo

-Embudo de vidrio

-Papel filtro

-Pipetas volumétricas

-Pipetas mohr

-Agitador

-Gradilla

-Centrifugadora

-Baño de hielo

-Espectrofotómetro UV-Visible

Reactivos.

-Solución de sulfato de Zinc 10%

-Solución de NaOH 0.5 N

-Solución de fenol 5%

-Acido Sulfúrico concentrado

-Solución patrón de carbohidrato



Procedimiento.

Desproteinización de las muestras.

-Pesar 2 g de muestra homogenizada y suspender en 20 mL agua desmineralizada. Homogenizar.

-Filtrar y tomar 10 mL del filtrado, a este adicionar 1 mL de una solución de Sulfato de Zinc al 10% y 1 mL de NaOH 0.5 N.

-Mantener en reposos durante 15 minutos y luego centrifugar a 200 rpm durante 15 minutos. Utilizar el sobrenadante para la cuantificación de azucares totales.

Determinación de Azucares Totales

NOTA. Realizar todo el procedimiento para un tubo antes de seguir con el siguiente.

-Preparar una solución o suspensión de la muestra en agua, procurando que los carbohidratos se encuentren en el intervalo de sensibilidad del método (10-100μg/mL).

-En tubos de ensayo perfectamente etiquetados, colocar 1 mL de la solución o suspensión acuosa de la muestra.

-Para cada tubo adicionar 0.6 mL de una solución acuosa de fenol al 5%. Mezclando perfectamente.

-Adicionar cuidadosamente 3.6 mL de ácido sulfúrico concentrado, homogeneizar.

-Dejar enfriar la mezcla a temperatura ambiente (aproximadamente 30 min.).

-Determinar la intensidad del color naranja obtenido en un espectrofotómetro a 490 nm, frente a un blanco preparado de la misma manera utilizando agua desmineralizada.

-Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a partir de una curva patrón preparada con el carbohidrato de interés en el intervalo del método, tratada de la misma manera que el problema.

 

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Determinación de la Fibra Bruta por el Método de Wijkstrom

Reactivos necesarios:

Acido sulfúrico H2SO4  0.32M  (17.76 mL 96% diluir a 1 litro con agua destilada)

Hidróxido de potasio KOH 0.556M (31.02g KOH disolver en agua destilada y llevar a 1 litro)

Antiespumante, por ejemplo Octanol.

Acetona

 

Material necesario:

Equipo Dosi-Fiber

Balanza ±0.1 mg

Trompa o bomba de vacío

Frasco Kitasatos

Crisoles porosos

Horno de mufla 500°C

Estufa 150°C

Desecador

 

Procedimiento:

1.       Pesar  (con una precisión de ±1mg) de 1 a 1.5 g de muestra en un crisol poroso. La cantidad de muestra es W­0

2.       Introducir los crisoles en el Dosi-Fiber

 

Hidrólisis ácida en caliente:

3.       Asegurarse de que las válvulas están en la posición “Cerrado”.

4.       Añadir 100-150 de H2SOcaliente en cada columna y unas gotas de antiespumante.

5.       Abrir el circuito de refrigeración y activar las resistencias calefactores. (Potencia 90%)

6.       Esperar a que hierva, reducir la potencia al 30% y dejar hervir durante el tiempo de extracción (30 minutos a una hora dependiendo del material). Para una hidrólisis mas efectiva accionar la bomba de aire en la posición soplar.

7.       Para la calefacción. Abrir el circuito de vacío y poner los mandos de las válvulas en posición “Absorción”. Lavar con agua destilada y filtrar. Repetir este proceso tres veces.

 

Hidrólisis básica en caliente:

8.       Repetir los pasos del 3 al 7 pero utilizando KOH en lugar de H2SO4.

 

Extracción en frío con acetona:

Este paso no se realizara en el equipo Dosi-Fiber.

9.       Preparar el frasco Kitasatos con las trompas de vacío. Situar el crisol en la entrada del Kitasatos y añadir acetona a la vez que el circuito de vacío esta absorbiendo. Repetir esta operación 3 veces.

10.   Poner las muestras a secar en la estufa a 150°C durante 1 hora.

11.   Dejar enfriar en desecador.

12.   Pesar con una precisión de ­­±0.1mg. la cantidad pesada es W1.

13.   Incinerar las muestras de los crisoles en el horno de mufla a 500°C durante un mínimo de 3 horas. Para evitar la rotura de los crisoles, colocar estos antes de encender el horno y dejar que alcancen la temperatura para comenzar a contar las 3 horas.

14.   Dejar enfriar en desecador. Teniendo cuidado de no exponer los crisoles a cambios bruscos de temperatura.

15.   Pesar los crisoles con una precisión de ±0.1mg. la cantidad pesada es W2.

16.   Realizar el siguiente cálculo.

 

%Fibra bruta= [(W1-W2)/W0] x100

 

 

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Extraccion de Fibra Cruda por el Metodo de Weede.

La fibra cruda es el termino con el que se denomina al residuo resultante de la incineración despues de haber sufrido una digestión ácida y básica. Existen muchos métodos para la determinación de la fibra cruda, uno de estos es el método de Weede o de Weende.

Reactivos necesarios:

Acido Sulfúrico H2SO4   0.128M (7.1 mL 96% diluir a un Litro con agua destilada)
Hidróxido potásico KOH  0.223M  (12.5 g disolver y llevar a un Litro)
Octanol (antiespumante)
Acetona
Material necesario
Equipo Dosi-Fiber
Balanza ­± 0.1 mg
Trompa o bomba de vacío
Frascos Kitasatos
Crisoles porosos
Horno de mufla 500°C
Estufa 150°C
Desecador
Procedimiento:
1.       Pesar  (con una precisión de ±1mg) de 1 a 1.5 g de muestra en un crisol poroso. La cantidad de muestra es W­0
2.       Introducir los crisoles en el Dosi-Fiber
Hidrólisis ácida en caliente:
3.       Asegurarse de que las válvulas están en la posición “Cerrado”.
4.       Añadir 100-150 de H2SO4 caliente en cada columna y unas gotas de antiespumante.
5.       Abrir el circuito de refrigeración y activar las resistencias calefactores. (Potencia 90%)
6.       Esperar a que hierva, reducir la potencia al 30% y dejar hervir durante el tiempo de extracción (30 minutos a una hora dependiendo del material). Para una hidrólisis mas efectiva accionar la bomba de aire en la posición soplar.
7.       Para la calefacción. Abrir el circuito de vacío y poner los mandos de las válvulas en posición “Absorción”. Lavar con agua destilada y filtrar. Repetir este proceso tres veces.
Hidrólisis básica en caliente:
8.       Repetir los pasos del 3 al 7 pero utilizando KOH en lugar de H2SO4.
Extracción en frio con acetona:
Este paso no se realizara en el equipo Dosi-Fiber.
9.       Preparar el frasco Kitasatos con las trompas de vacío. Situar el crisol en la entrada del Kitasatos y añadir acetona a la vez que el circuito de vacío esta absorbiendo. Repetir esta operación 3 veces.
10.   Poner las muestras a secar en la estufa a 150°C durante 1 hora.
11.   Dejar enfriar en desecador.
12.   Pesar con una precisión de ­­±0.1mg. la cantidad pesada es W1.
13.   Incinerar las muestras de los crisoles en el horno de mufla a 500°C durante un mínimo de 3 horas. Para evitar la rotura de los crisoles, colocar estos antes de encender el horno y dejar que alcancen la temperatura para comenzar a contar las 3 horas.
14.   Dejar enfriar en desecador. Teniendo cuidado de no exponer los crisoles a cambios bruscos de temperatura.
15.   Pesar los crisoles con una precisión de ±0.1mg. la cantidad pesada es W2.
16.   Realizar el siguiente cálculo.
%Fibra bruta= [(W1-W2)/W0] x100
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